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Les développements méthodologiques du METi sont fortement adossés à l´activité de recherche du LBME qui met en œuvre depuis plus de 30 ans la microscopie électronique pour comprendre les mécanismes d´expression génique, en particulier la synthèse des particules ribonucléoprotéiques et l´organisation fonctionnelle du noyau. La microscopie électronique est utilisée à différentes échelles : la description ultrastructurale des domaines nucléaires et la localisation intracellulaire des protéines et ARN impliqués dans ces mécanismes, mais aussi l´observation de molécules ou de complexes macromoléculaires isolés et la détermination de leurs structures tridimensionnelles.
Le travail de recherche au LBME a amené la plateforme à se doter au fil des ans de moyens avancés en microscopie électronique pour étudier l'organisation fonctionnelle du noyau cellulaire. Le laboratoire fut parmi les premiers en France à acquérir un appareil de congélation ultra-rapide pour cryofixer les échantillons cellulaires et améliorer leur morphologie. L'utilisation de cette technique a ainsi permis de révéler l’organisation spatiale du nucléole chez les levures Schizosaccharomyces pombe et Saccharomyces cerevisiae de manière inédite (1-3). En 2007, la tomographie électronique a été introduite avec l'acquisition du microscope JEM-2100 CRP 200 keV afin d'accéder à une visualisation des échantillons en trois dimensions et d'améliorer la résolution axiale pour des coupes cellulaires. Grâce à cette technique, il est désormais envisageable de détecter des complexes macromoléculaires dans leur environnement cellulaire par analyse d’image. L'observation des corps pré-nucléolaires par tomographie dans des cellules humaines a mis en évidence la présence de pré-ribosomes, intermédiaires de maturation des sous-unités ribosomiques (4). L'arrivée de ce microscope a également ouvert la voie à l'implémentation de la cryomicroscopie électronique, qui est mise en œuvre pour déterminer la structure 3D des pré-ribosomes à différents stades de maturation. Notre objectif à terme est d'approcher la structure de ces complexes in situ en intégrant ces données de biologie structurale dans l'observation de coupes cellulaires en tomographie. Enfin, l'utilisation d'approches corrélatives permet de combiner la résolution et la description ultrastructurale apportée par la microscopie électronique avec la sensibilité et la flexibilité de la microscopie de fluorescence, qui se prête à l'observation de cellules vivantes. Il est alors possible, grâce à la fluorescence, d'orienter l'observation en microscopie électronique d'évènements rares ou de structures difficiles à reconnaître par leur morphologie, ou encore de repérer dans les cellules vivantes la fenêtre temporelle adéquate pour la préparation des échantillons. Les développements en cours au LBME devraient permettre à terme de coupler la microscopie électronique avec la microscopie de fluorescence super-résolue.
Cette activité en microscopie électronique s'est développée en lien avec le séquençage des génomes qui a marqué le début d'une nouvelle ère dans l'étude de l'expression génique. Premier organisme dont le génome a été entièrement séquencé en 1997, la levure S. cerevisiae est devenue un organisme-modèle essentiel pour étudier des mécanismes comme l'assemblage des ribosomes ou la dynamique des chromosomes. La microscopie électronique au LBME est mise en œuvre pour l'étude de plusieurs facteurs participant à la synthèse des sous-unités ribosomiques, parmi les plus de 150 identifiés par protéomique. La localisation sub-nucléaire de ces protéines a ainsi pu être précisée par immunodétection et associée à la détection des ARN associés par hybridation in situ. Par ailleurs, l'approche ultrastructurale a également permis de caractériser les changements induits par la mutation de ces facteurs sur l'organisation du noyau, le transport des particules pré-ribosomiques (5-7). De la même manière, l'étude de l'anémie de Diamond-Blackfan, une maladie rare liée à la mutation de gènes de protéines ribosomiques, a mis en lumière la désorganisation du nucléole associée à des défauts de formation des ribosomes dans des cellules de patients (8). La transcription des gènes ribosomiques peut être directement visualisée en réalisant des étalements chromatiniens suivant la technique de Miller, ou "arbres de Noël", permettant de déterminer directement des paramètres comme le nombre de polymérases actives par gène (9) et la taille des gènes (10). Les développements en cours des techniques d'édition du génome amènent de nouvelles techniques pour détecter et modifier gènes, ARN et protéines. Nul doute que la combinaison de ces méthodologies génétiques avec les avancées techniques de la microscopie électronique en transmission (CEMOVIS, reconnaissance de formes…) génèrera de nouveaux outils pour appréhender l'ultrastructure du noyau et les mécanismes de l'expression génique.
